Глава 2. Начало репликации

Репликация ДНК начинается не в любой случайной точке молекулы, а в специфических местах, называемых точками начала репликации или олриджинами. Процесс копирования продолжается через образование репликативных вилок в одном или обоих направлениях до тех пор, пока ДНК полностью не удвоится. В замкнутых кольцевых молекулах ДНК новосинтезированные цепи ковалентно соединяются в местах встречи увеличивающихся в размере репликативных вилок или в том месте, где единственная вилка возвращается к точке начала репликации. Дочерние молекулы, как правило, расходятся еще до начала нового раунда репликации.

Такие различающиеся по размеру геномы, как геном вируса SV40 (5,2тпн), бактериофага λ (48,5тпн) и Е. соli (4-103тпн), воспроизводятся в результате одного инициирующего события, происходящего в определенной точке.


Рис. 2. Возможное движение репликативной вилки.


У про– и эукариот можно встретить различные вариации на эту тему. Так, каждая из цепей родительской спирали митохондриальной ДНК животных (15тпн) имеет свою точку начала репликации. Синтез комплементарной цепи некоторых небольших однонитевых фаговых геномов начинается вблизи одной специфической последовательности, а репликация полученного дуплекса может инициироваться совсем в другой точке. Репликация линейных двунитевых ДНК также инициируется в особых сайтах. Например, ДНК бактериофага Т7 (40тпн) реплицируется в двух противоположных направлениях к разным концам молекулы, начиная от одной точки, а каждая из двух цепей ДНК аденовируса человека (30–38 тпн) реплицируется последовательно всегда от З'-конца.

Для геномов эукариотических клеток характерно наличие множественных точек начала репликации, разбросанных по хромосоме на расстоянии около 20тпн. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор, пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких, независимо инициированных новосинтезированных нитей.

2.1. Понятие о репликоне и ориджине репликации

Участок ДНК, на котором синтезируется отдельный фрагмент лидирующей нити, называется репликоном. У многих прокариот их геном содержит только одну точку инициации репликации, то есть у них в ДНК только один репликон. Эукариотические геномы полирепликонны.

Место начала репликона, в котором происходит инициация репликации, носит название ориджина репликации. Именно ориджин распознается специальными белковыми комплексами и на нем начинается формирование вилки репликации.

В некоторых случаях место начала репликации имеет такую нуклеотидную последовательность, что дуплекс принимает необычную конфигурацию, которую распознают белки, участвующие в инициации. Природа взаимодействия между точкой начала репликации и белками и механизм инициации в целом исследованы недостаточно, однако можно сказать, что, по-видимому, они в разных случаях различны.

2.2. Ориждин репликации E.coIi oriC

Наиболее подробно изучены ориджины у Е. соli и Bacillus subtilis. Область начала репликации хромосомы, оriС (origin of chromosome), включает в себя участки со специфическими последовательностями, так называемыми ДНК-боксами, и расположенными между ними короткими последовательностями. ДНК-боксы со специфическим «мотивом» нуклеотидов, преимущественно в 9пн, перемежаются фрагментами в 12-1Зпн с высоким содержанием АТ. Сами девятичленные последовательности могут располагаться как в прямом, так и в инвертированном положении по отношению друг к другу. Например, у В. subtilis имеется один фрагмент ТТАТССАСА и два других девятичленных бокса, ориентированных в противоположном направлении, с заменой одной из пар нуклеотидов. Всего у В. subtilis на оriС расположено 15 ДНК-боксов. Область оriС очень консервативна: ДНК-боксы сходного состава имеются в соответствующем месте хромосомы у других бактерий (только у Mycoplаsma genitalium, несмотря на наличие общих для всех бактерий ферментов репликации, ДНК-боксов найдено не было). Сами ДНК-боксы не кодируют белок или РНК, хотя между ними располагаются отдельные гены. Продукты этих генов также большей частью вовлечены в «обслуживание» процесса репликации ДНК.

Порядок расположения ДНК-боксов, промежуточных областей и их количество позволяют думать, что эволюционная дивергенция oriС шла главным образом за счет дупликаций и трипликаций. Схема абстрактного «минимального ориджина» прокариот представлена на рис. 3.



Рис. 3. Организация минимального ориджина прокариот

Схема минимального ориджина прокариот.

2.3. Ориджины других организмов

Коровая часть ориджина репликации у вируса SV40 состоит из элемента опознания (ORE – origin recognition element), необходимого для связывания особого белка Т-антигена (Т-аg), элемента для связывания белка, расплетающего ДНК (DUE – DNA unwinding element), и элемента, обогащенного АТ-нуклеотидами. Участок, с которого вилка репликации начинает двигаться в противоположных направлениях, называется началом двунаправленной репликации (OBR – origin bidirectional replication).

Вспомогательные элементы (Aux) связывают димеры Т-антигена (Аux-1) и фактор транскрипции Sp1 (Аuх-2). Расстояние между этими элементами и их ориентация играют важную роль в процессе инициации репликации. Схема ориджина вируса SV40 представлена на рис. 4.

У эукариот гомологами ориджинов репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, или ARS (autonomously replicating sequences), открытые в 1980 г. Р. Дэйвисом и Дж. Карбоном.


Рис. 4. Схема ориджина вируса SV40.


У дрожжей Saccharomyces cerevisiae особые последовательности, способные обеспечивать репликацию фрагментов ДНК в дрожжевой клетке были выделены раньше, чем у других эукариот. Позднее такие последовательности были найдены и у многих других организмов. У S.cerevisiae АRS занимает 100—200пн и содержит специфическую консенсусную последовательность (АСS – ARS consensus sequence), размером в 11пн, необходимую для связывания с белком-инициатором, а также дополнительные элементы (В-элементы), усиливающие функцию ориджина. Например, АRS1 – первый подробно охарактеризованный ориджин – содержит три таких элемента – В1, В2, ВЗ. Последовательности АCS и В1 занимают приблизительно 50пн и представляют собой наименьшую функциональную область любого ориджина, которая требуется для связывания с белком-инициатором.

Элемент В2 обычно содержит генетически охарактеризованный участок DUE. Вспомогательный элемент ВЗ связывает фактор транскрипции Abf-1. Общая длина ARS-элемента составляет 100-200пн. Строение ориждина S.cerevisiae представлено на рис. 5.


Рис. 5. Схема ориджина Saccharomyces cereiseae


У другого вида дрожжей, Shizosaccharomyces pombe, ориджины состоят по крайней мере из одной ARS, которая значительно длиннее, чем у S. cerevisiae. В некоторых случаях несколько ARS-элементов формируют зону инициации репликации. (Рис. 6.)


Рис. 6. Схема ориджина Shizosaccharomyces pombe


У млекопитающих ориджины детально не охарактеризованы, некоторые из них располагаются в межгенных промежутках, имеют сайты связывания для транскрипционных факторов, часто содержат только районы инициации двунаправленной репликации – OBR.

2.4. Скорость репликации

Скорость репликации генома регулируется в основном частотой инициирующих событий. Так, у Е. соli скорость копирования в каждой репликативной вилке постоянна и равна примерно 1500пн в секунду: следовательно, полный геном длиной 4·106пн реплицируется примерно за 40 мин. Если хромосома реплицируется быстрее, это значит, что увеличивается частота актов инициации в той же самой точке начала репликации при прежней скорости копирования. Клетки Е. соli делятся каждые 20 мин; это означает, что репликация ДНК инициируется в хромосомах, еще не закончивших предыдущий раунд репликации. Скорость движения репликативной вилки в эукариотических клетках значительно меньше (10-100пн в секунду), но завершение репликации хромосомы в разумное время обеспечивается одновременной инициацией во множестве точек. Итак, скорость репликации хромосом контролируется числом и расположением точек начала репликации. Например, в ранних эмбрионах дрозофилы репликация отдельной хромосомы осуществляется каждые 3 мин, благодаря почти одновременной инициации событий в точках, отстоящих друг от друга на 7000-8000пн. В тоже время известно, что у дрозофилы в ходе раннего эмбрионального развития, как скорость репликации, так и размеры и число репликонов тканеспецифичны. В культуре же соматических клеток той же дрозофилы скорость удвоения хромосом значительно более медленная, так как репликация начинается в гораздо меньшем числе точек, находящихся друг от друга на расстоянии 40000пн, при этом продолжительность S-фазы составляет 600 мин. Следовательно, при фиксированной скорости синтеза ДНК множественная инициация повышает скорость процесса репликации в целом и таким образом уменьшает время, необходимое для удвоения всего набора хромосом. Данные о числе репликонов и скорости репликации приведены в табл.1.

Различия в продолжительности S-фазы найдены и у других организмов. Например, у тритона S-фаза длится 1 ч в ядрах бластулы и 200 ч в предмейотической S-фазе сперматоцитов. Вероятно, длительность S-фазы определяется не скоростью синтеза ДНК, а числом задействованных ориджинов репликации. В ДНК клеток нейрулы тритона они находятся на расстоянии около 40 мкм друг от друга, а в соматических клетках – около 100 мкм.


Таблица 1

Число и длина репликонов у разных организмов.



В соответствии с современными представлениями репликоны у эукариот распределены в геноме не случайно, они расположены группами (replicon foci). В этих группах, или фокусах, собираются ферменты репликации, которые удлиняют вилки репликации одновременно 10-100 соседних репликонов длиной примерно по 100тпн каждый. Репликация в них завершается за 45–60 мин. Кроме этого существуют очень длинные репликоны (более 1000тпн) – столь большие, что репликация в них продолжается по нескольку часов.

Активация ориджинов репликации происходит на протяжении всей S-фазы. Например, АRS1 S.cerevisiae активируется в ранней, а АRS501 – в поздней S-фазе. Большинство ориджинов активируется в середине S-фазы. Интересно отметить, что участки хромосом S.cerevisiae, реплицирующиеся в ранней или поздней S-фазе, располагаются мозаично, то есть перемешаны. У S.cerevisiae было обнаружено, что центральная область хромосомы IV реплицируется в ранней, а теломеры – в поздней S-фазе. Участок ДНК размером 67тпн, прилежащий к теломере на правом конце хромосомы V и содержащий АRS501, реплицируется в поздней S-фазе. По-видимому, поздняя репликация этого участка хромосомы является следствием его соседства с теломерой. Кроме того, известно, что в конце S-фазы реплицируются "молчащие" гены, например неэкспрессирующиеся в определенных типах клеток локусы НМL и НМR, которые локализованы в субтеломерных областях. Активно экспрессирующиеся гены, например локус МАТ, напротив, реплицируются в первой половине S-фазы.