3 Морфология, морфогенез, биофизические свойства и генетика вирусов
3.1 Архитектура вирионов
Внеклеточная форма вируса – вирион, предназначенная для сохранения и переноса нуклеиновой кислоты вируса, характеризуется собственной архитектурой, биохимическими и молекулярно-генетическими особенностями. Под архитектурой вирионов понимают ультратонкую структурную организацию этих надмолекулярных образований, различающихся размерами, формой и сложностью строения. Для описания архитектуры вирусных структур разработана номенклатура терминов:
Белковая субъединица – единая, уложенная определенным образом полипептидная цепь.
Структурная единица (структурный элемент) – белковый ансамбль более высокого порядка, образованный несколькими химически связанными идентичными или неидентичными субъединицами.
Морфологическая единица – группа выступов (кластер) на поверхности капсида, видимая в электронном микроскопе. Часто наблюдаются кластеры, состоящие из пяти (пентамер) и шести (гексамер) выступов. Это явление получило название пентамерно-гексамерной кластеризации. Если морфологическая единица соответствует химически значимому образованию (сохраняет свою организацию в условиях мягкой дезинтеграции), то применяют термин капсомер.
Капсид – внешний белковый чехол или футляр, образующий замкнутую сферу вокруг геномной нуклеиновой кислоты.
Кор (core) – внутренняя белковая оболочка, непосредственно примыкающая к нуклеиновой кислоте.
Нуклеокапсид – комплекс белка с нуклеиновой кислотой, представляющий собой упакованную форму генома.
Суперкапсид или пеплос – оболочка вириона, образованная липидной мембраной клеточного происхождения и вирусными белками.
Матрикс – белковый компонент, локализованный между суперкапсидом и капсидом.
Пепломеры и шипы – поверхностные выступы суперкапсида.
Как уже отмечалось, вирусы могут проходить через самые микроскопические поры, задерживающие бактерии, за что и были названы фильтрующимися агентами. Свойство фильтруемости вирусов обусловлено размерами, исчисляемыми нанометрами (нм), что на несколько порядков меньше, чем размеры самых мелких микроорганизмов. Размеры вирусных частиц, в свою очередь, колеблются в относительно широких пределах. Самые мелкие просто устроенные вирусы имеют диаметр чуть больше 20 нм (парвовирусы, пикорнавирусы, фаг Qβ), вирусы средних размеров – от 100 до 150 нм (аденовирусы, коронавирусы). Наиболее крупными признаны вирусные частицы осповакцины, размеры которых достигают 170 × 450 нм. Длина нитевидных вирусов растений может составлять 2000 нм.
Представители царства Vira характеризуются разнообразием форм. По своей структуре вирусные частицы могут быть простыми образованиями, а могут представлять собой достаточно сложные ансамбли, включающие несколько структурных элементов.
Существует два типа вирусных частиц (ВЧ), принципиально отличающихся друг от друга:
1) ВЧ, лишенные оболочки (безоболочечные или непокрытые вирионы);
2) ВЧ, имеющие оболочку (оболочечные или покрытые вирионы).
Строение вирионов, лишенных оболочки. Выделено три морфологических типа вирионов, лишенных оболочки: палочковидные (нитевидные), изометрические и булавовидные (рис. 2). Существование первых двух типов непокрытых вирионов определяется способом укладки нуклеиновой кислоты и ее взаимодействием с белками.
1 Белковые субъединицы связываются с нуклеиновой кислотой, располагаясь вдоль нее периодическим образом так, что она сворачивается в спираль и образует структуру под названием нуклеокапсид. Такой способ регулярного, периодического взаимодействия белка и нуклеиновой кислоты определяет образование палочковидных и нитевидных вирусных частиц.
2 Нуклеиновая кислота не связана с белковым чехлом (возможные нековалентные связи очень подвижны). Такой принцип взаимодействия определяет образование изометрических (сферических) вирусных частиц. Белковые оболочки вирусов, не связанные с нуклеиновой кислотой, называют капсидом.
3 Булавовидные вирионы обладают дифференцированной структурной организацией и состоят из ряда дискретных структур. Основными структурными элементами вириона являются изометрическая головка и хвостовой отросток. В зависимости от вируса в структуре вириона также могут присутствовать муфта, шейка, воротничок, хвостовой стержень, хвостовой чехол, базальная пластинка и фибриллы. Наиболее сложную дифференцированную структурную организацию имеют бактериофаги T-четной серии, вирион которых состоит из всех перечисленных структурных элементов.
Вирионам или их компонентам могут быть присущи два основных типа симметрии (свойство тел повторять свои части) – спиральный и икосаэдрический. В том случае, если компоненты вириона обладают разной симметрией, то говорят о комбинированном типе симметрии ВЧ (рисунок 2 а).
Спиральная укладка макромолекул описывается следующими параметрами: числом субъединиц на виток спирали (u, число необязательно целое); расстоянием между субъединицами вдоль оси спирали (p); шагом спирали (P); P = pu. Классическим примером вируса со спиральным типом симметрии является вирус табачной мозаики (ВТМ). Нуклеокапсид этого палочковидного вируса размером 18 × 300 нм состоит из 2130 идентичных субъединиц, на виток спирали приходится 16 1/3 субъединиц, шаг спирали составляет 2,3 нм (рисунок 2 б).
1-структурная единица капсида; 2-морфологическая единица капсида (капсомер); 3-капсид; 4-нуклеиновая кислота; 5-суперкапсид.
Рисунок 2 – Кубическая (а) и спиральная (б) симметрия капсидов сложно устроенных вирусов (схема)
Икосаэдрическая симметрия – самая эффективная для конструирования замкнутого чехла из отдельных субъединиц. При рассмотрении элементов икосаэдрической симметрии следует различать понятия симметрия и форма. Симметрия в данном случае – это набор поворотов, которые переводят объект сам в себя, форма – это лишь общий вид кубической поверхности объекта (тетраэдр, октаэдр, додекаэдр и т.д.). Многие объекты, имея икосаэдрическую симметрию, не имеют икосаэдрической формы. Икосаэдр – это геометрическая фигура, имеющая 12 вершин, 20 граней, 20 ребер.
Наименьшее число структурных элементов, способных образовать икосаэдр, равно 60, однако капсиды сложноустроенных вирусов могут быть образованы 60 n структурными элементами. Для описания икосаэдрической упаковки структурных элементов в капсиде введено так называемое триангуляционное число (T). Это число, равное частному от деления числа субъединиц на 60. Так, у вируса некроза табака и фага φX174 T = 1 (60 субъединиц), многие вирусы растений имеют T = 3 (180 субъединиц), вирус Синдбис имеет T = 4 (240 субъединиц), ротавирус имеет T = 13 (780 субъединиц).
Многие крупные икосаэдрические вирусы для получения плотной упаковки капсида формируют субтриангуляции на основе структур меньших размеров, что предполагает наличие разных типов субъединиц на вершинах икосаэдра и нарушение локальной симметрии в местах их контактов. В этом случае наблюдается расхождение между реально существующей симметрией ВЧ и видом структуры с соответствующим числом Т. Наиболее простую конструкцию капсида, построенного по такому принципу, имеют паповавирусы. Их капсид образован 72 морфологическими единицами, каждая построена из трех белковых субъединиц, организованных в пентамеры, а ВЧ имеет вид структуры с Т = 7.
Более сложная структура вириона наблюдается у аденовируса, капсид которого организован по принципу ансамблей, обладает строгой икосаэдрической симметрией и имеет вид структуры с Т = 25. На вершинах икосаэдра находятся кластеры – пентоны, содержащие в основании так называемые фибры – стержень с утолщением на конце. Остальная структура капсида построена из гексонов. Гексоны и пентоны – это простейшие подструктуры капсида аденовирусов. Всего в состав аденовириона входит 12 оснований пентонов и 240 гексонов. При диссоциации в мягких условиях образуются надструктуры (капсомеры), состоящие из 9-ти гексонов.
Еще более сложноустроенные вирионы, на пример частицы бактериофагов Tчётной серии, обладают комбинированным типом симметрии. Так, головка бактериофага T4 имеет икосаэдрический тип симметрии, а сокращенный чехол хвостового отростка обладает спиральным типом симметрии. В целом вирион фага T4 обладает комбинированным типом симметрии.
Строение вирионов с оболочкой. Другой тип вирусных частиц – это покрытые или оболочечные вирионы. Оболочечные вирионы, также как и непокрытые, могут быть палочковидными, нитевидными и изометрическими разной формы – от четко очерченных кирпичеобразных вирионов вируса оспы до плейоморфных частиц вирусов герпеса и коронавирусов, имеющих различные размеры и форму.
Оболочка вириона (пеплос, суперкапсид) состоит из липидсодержащей мембраны клеточного происхождения (цитоплазматической мембраны, мембраны эндоплазматического ретикулюма или аппарата Гольджи, ядерной мембраны) и вирусных гликопротеинов, встроенных в мембрану. Оболочку вирионы приобретают в процессе почкования через ту или иную мембрану.
Вирусные гликопротеины, находящиеся в мембране, как правило, формируют поверхностные выступы, называемые шипами и пепломерами. Эти поверхностные выступы характеризуются разной степенью упорядоченности и могут быть представлены одним белком (вирус кори) или двумя разными белками (вирусы гриппа, ретровирусы), могут быть образованы мономерами белка или его димерами и тримерами.
Таким образом, структурная организация вириона описывается двумя характеристиками – наличием/отсутствием оболочки и типом симметрии капсида. Оболочечные вирионы могут обладать икосаэдрической, спиральной и комбинированной симметрией капсида, также как и безоболочечные.
3.2 Морфогенез вирусов
При внутриклеточной репродукции вирусов формируются структуры, отсутствующие в незаряженных вирусом клетках. Эти образования – места синтеза и сборки субвирусных структур (компонентов дочерних вирионов) получили разные наименования – клеточные матриксы «фабрики», виропласты, включения. Эти структуры являются продуктами кооперативных процессов клетки и вируса, где главенствующая роль принадлежит клетке.
Морфологически матриксы выглядят по-разному у разных вирусов. Обычно это места синтеза белков, и поэтому в матриксах обнаруживаются значительные скопления рибосом (полисомы). В их состав входят также разные клеточные структуры – мембраны, микротрубочки, и т. п. При этом матриксы проделывают определенный цикл развития. Если вначале в них превалируют полисомы, то позже являются субвирусные компоненты, которые можно выявить при использовании серологических методов исследования типа ИФ или ИЭМ, а нередко и при обычной ЭМ. При ряде инфекций матриксы связаны с мембранами эндоплазматической сети, аппаратом Гольджи и другими клеточными структурами, куда транспортируются все вирусные компоненты.
Образования, сходные с цитоплазматическими матриксами, обнаружены также в ядрах, где происходит репродукция большинства ДНК-содержащих вирусов. При окрашивании клеток они имеют вид внутриядерных включений. На поздних стадиях инфекции в матриксах или по соседству с ними накапливается большое число вирионов, часто образующих кристаллоподобные формирования. Внутриядерные кристаллоподобные включения обнаружены, например, у реовирусов, аденовирусов, паповавирусов, парвовирусов. Процесс формирования вирионов у вирусов, имеющих липопротеидные оболочки, значительно более сложен, чем у просто устроенных вирусов, и протекает многоступенчато. Так, например, изометрические нуклеокапсиды вируса герпеса формируются в ядрах и в дальнейшем транспортируются в цитоплазму путем почкования через ядерную мембрану. После этого вирионы транспортируются к аппарату Гольджи, проходя через мембрану эндоплазм этической сети и захватывая ее, как это было при прохождении через ядерную мембрану. Поэтому внеклеточный вирус имеет две оболочки, одна из которых формируется из ядерной, вторая – из цитоплазматической мембраны.
Формирование РНП вирионов парамиксовирусов происходит в цитоплазме, где они накапливаются в виде тяжей и затем транспортируются к плазматической мембране. В это время плазматическая мембрана клетки уже модифицирована, так как в нее встроены с наружной стороны вирусные гликопротеиды, а с внутренней стороны – матриксный белок. При приближении к таким модифицированным участкам плазматической мембраны рибонуклеопротеидные тяжи свертываются в плотно упакованные клубки и, проходя через плазматическую мембрану, покрываются ею, приобретая таким путем внешнюю оболочку. Этот тип формирования вирионов называется почкованием. Почкование может происходить и во внутриклеточные вакуоли.
Морфогенез вируса оспы еще более сложен. В цитоплазме образуются сложные матриксы, в которых происходит синтез многочисленных вирусспецифических структур. Здесь же происходит и формирование вирионов, которые вначале представляют пузырчатые образования, и лишь позже из этих предшественников формируются зрелые вирионы. Выход вирусных частиц из клетки осуществляется либо путем почкования через мембраны во внутриклеточные вакуоли, либо при разрушении клетки.
3.3 Биофизические свойства вирусов
Биофизические свойства вирусов характеризуются многими показателями – седиментацией, плотностью, вязкостью вирусных суспензий, диффузионными свойствами. Все эти характеристики относятся также к субвирусным компонентам. Наиболее важными биофизическими характеристиками вирусов являются седиментационные и плотностные свойства. Они чаще всего измеряются при исследовании вирусов.
Седиментационные свойства вирусов и субвирусных компонентов измеряют с помощью центрифугирования в аналитических и препаративных ультрадентрифугах. Коэффициент седиментации выражают в единицах Сведберга в переводе на стандартные условия при температуре 20 °С в воде и обозначают как S20w.
Коэффициенты седиментации вирионов зависят от многих факторов: от их размера и массы, плотности, формы. Для определения плотности вирионов и субвирусных структур применяют равновесное центрифугирование в градиентах плотности. Для вирионов и вирусных нуклеопротеидов обычно используют градиенты плотности сахарозы и хлорида цезия.
Плотность вирионов и субвирусных структур зависит, прежде всего, от их состава. Она увеличивается с увеличением процента содержания нуклеиновых кислот и уменьшается при повышении содержания белков и липидов.
3.4 Устойчивость вирусов в окружающей среде
Разные группы вирусов обладают неодинаковой устойчивостью во внешней среде. Наименее устойчивыми являются вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, наиболее устойчивыми – изометрические вирусы. Так, например, ортомиксовирусы и парамиксовирусы инактивируются на поверхностях в течение нескольких часов, тогда как вирусы полиомиелита, аденовирусы, реовирусы сохраняют инфекционную активность в течение нескольких дней.
Однако из этого общего правила имеются и исключения. Так, вирус оспы устойчив к высыханию и сохраняется в экскретах в течение многих недель и месяцев. Вирус гепатита В устойчив к действию неблагоприятных внешних факторов и сохраняет свою активность в сыворотке даже при кратковременном кипячении.
Чувствительность вирусов к ультрафиолетовому и рентгеновскому облучению зависит преимущественно от размеров их генома. Поэтому, например, вирус осповакцины (молекулярная масса генома около 2 × 108) инактивируется при рентгеновском облучении около 5 × 104 рад, в то время как мелкий вирус папилломы (молекулярная масса генома 3 × 106) для инактивации требует облучения 4 × 105 рад.
Чувствительность вирусов к инактивации формальдегидом и другими химическими веществами, инактивирующими генетический материал, зависит от многих условий, среди которых следует назвать плотность упаковки нуклеиновой кислоты в белковый футляр, размеры генома, наличие или отсутствие внешних оболочек и т.п. Вирусы, имеющие липопротеидные оболочки, чувствительны к эфиру, хлороформу и детергентам, в то время как просто устроенные изометрические и палочковидные вирусы устойчивы к их действию.
Наконец, важной особенностью вирусов является чувствительность к рН. Есть вирусы, устойчивые к кислым значениям рН (2,2 – 3,0), например, вирусы, вызывающие кишечные инфекции и проникающие в организм алиментарным путем. Однако большинство вирусов инактивируется при кислых и щелочных значениях рН.
3.5 Классификация вирусов
Современная классификация вирусов является универсальной для вирусов позвоночных, беспозвоночных, растений и простейших. Она основана на фундаментальных свойствах вирионов, из которых ведущими являются признаки, характеризующие нуклеиновую кислоту, морфологию, стратегию генома и антигенные свойства (рисунок 3). Фундаментальные свойства поставлены на первое место, поскольку вирусы со сходными антигенными свойствами обладают и сходным типом нуклеиновой кислоты, сходными морфологическими и биофизическими свойствами.
Рисунок 3 – Схематическое строение семейств вирионов, поражающих позвоночных
Важным признаком для классификации, который учитывается наряду со структурными признаками, является стратегия вирусного генома, под которой понимают используемый вирусом способ репродукции, обусловленный особенностями его генетического материала. Например, полярность вирусной РНК является основным критерием для группировки вирусов и при отсутствии общих антигенных свойств.
Антигенные и другие биологические свойства являются признаками, лежащими в основе формирования вида и имеющими значение в пределах рода.
В основу современной классификации положены следующие основные критерии:
1) тип нуклеиновой кислоты (РНК или ДНК), ее структура (количество нитей);
2) наличие липопротеидной оболочки;
3) стратегия вирусного генома;
4) размер и морфология вириона, тип симметрии, число капсомеров;
5) феномены генетических взаимодействий;
6) круг восприимчивых хозяев;
7) патогенность, в том числе патологические изменения в клетках и образование внутриклеточных включений;
8) географическое распространение;
9) способ передачи;
10) антигенные свойства.
На основании перечисленных признаков вирусы делятся на семейства, подсемейства, роды и типы. Деление на семейства произведено по критериям, изложенным в пунктах 1 и 2, деление на роды и типы – на основании нижеперечисленных признаков. Схематически строение семейств вирионов, поражающих позвоночных, приведено на рисунке 5 Дополнительно выделены еще 2 семейства: Gepadnaviridae и Flaviviridae (выделенные из семейства Togaviridae).
Современная классификация вирусов человека и животных охватывает более 4/5 всех известных вирусов, которые распределены в 19 семейств, из них 7 – ДНК-содержащих и 12 – РНК-содержащих вирусов. Некоторые допускаются привычные латинизированные обозначения, цифры при обозначении типов, сокращения, буквы и их сочетания.
3.6 Характеристика геномов вирусов
В начале 1940-х годов стало более или менее ясно, что вирусы, как и другие живые организмы, содержат нуклеиновые кислоты. Однако, особенность строения вирусного генома заключается в том, что наследственная информация может быть записана как на ДНК, так и РНК в зависимости от типа вируса. Уникальное свойство вирусной РНК хранить наследственную информацию впервые было продемонстрировано Гирером, Шраммом и Френкель-Конратом при изучении инфекционности РНК вируса табачной мозаики (ВТМ). Было показано, что очищенные препараты РНК ВТМ сохраняют инфекционность при полном отсутствии белка. Это открытие противоречило всеобщему убеждению, что единственная роль РНК заключается в передаче информации от ДНК к белку. В настоящее время способность РНК служить хранилищем генетической информации уже ни у кого не вызывает сомнений.
Следует учитывать, что наличие одного вида нуклеиновой кислоты является характеристикой вириона, но не вируса. В жизненном цикле ДНК-содержащих вирусов геномная нуклеиновая кислота транскрибируется, образуя РНК. Присутствие у ДНК-содержащих вирусов (вирус осповакцины) ДНК-зависимой РНК-полимеразы было показано в 1967 г. Катес и МакАусланом. РНК-содержащие вирусы транскрибируют свой геном с использованием РНК-зависимой РНК-полимеразы, впервые обнаруженной у реовирусов в 1968 г. Целый ряд РНК-содержащих вирусов имеют в жизненном цикле стадию обратной транскрипции и синтезируют ДНК на матрице РНК с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНКполимераза или ревертаза). Открытие этого фермента в составе онкогенных РНК-содержащих вирусов сделано Балтимором в 1970 г.
Примерно 20 % вирусов имеют ДНК-геном, 80 % – РНК-геном. При этом РНК-геномные вирусы более древние в эволюционном отношение, нежели ДНК-геномные. Современные гипотезы предполагают, что примерно 4 миллиарда лет назад существовал мир РНК, в основе которого лежала РНК-самокопирующаяся система, обладающая каталитической активностью. Не исключается, что на этом этапе молекулярной эволюции уже существовали примитивные самореплицирующиеся вирусоподобные системы, отражением чего являются дошедшие до нашего времени вироиды – кольцевые РНК, обладающие рибозимазной активностью. На следующем этапе молекулярной эволюции РНК приобрела РНК-связывающие белки, которые выполняли роль кофакторов, стабилизирующих рибозимы. Возникновение систем РНК/белок явилось основой для появления сначала грубо-специфических белковферментов, а затем полимераз, совершенствование которых составило предмет эволюции механизмов репликации нуклеиновых кислот.
3.6.1 Особенности организации нуклеиновых кислот вирусов
По своей химической природе нуклеиновые кислоты вирусов не отличаются от нуклеиновых кислот клеток (организмов) и представляют собой полинуклеотидные цепи, образованные чередованием четырех дезоксирибонуклеотидов в случае ДНК или рибонуклеотидов в случае РНК, соединенных фосфодиэфирными связями. Нуклеотид представляет собой азотистое основание (аденозин (А), гуанозин (G), цитидин (C), тимидин (T) или уридин (U) в случае РНК), связанное с дезоксирибозой (в ДНК), или рибозой (в РНК) гликозидной связью. Фосфорная кислота в нуклеиновых кислотах присоединяется сложноэфирной связью к 3’– и 5’-ОН группам сахаров смежных нуклеотидов. Отличительной особенностью ДНК целого ряда вирусов бактерий является наличие метилированных оснований (5’-метилцитозина, 6’метиламинопурина), которые могут входить в состав ДНК в качестве минорных или мажорных оснований. Так, ДНК фагов fd и φХ174 (колифаги) содержит 1-2 метилированных основания, а в ДНК фага Х12, лизирующего морскую бактерию Xantomonas oryza, вообще нет обычного цитозина, который полностью замещен 5метилцитозином. Источником происхождения таких оснований является энзиматическое метилирование уже синтезированной цепи ДНК. Данный процесс осуществляют вирусспецифические метилазы, которые используют в качестве донора метильных групп S-аденозилметионин клетки хозяина.
Вирусные нуклеиновые кислоты характеризуются поразительным разнообразием форм. Вирусный геном может быть представлен как однонитчатыми, так и двунитчатыми молекулами РНК и ДНК. ДНК может быть как линейной, так и кольцевой молекулой (таблица 1), РНК – как непрерывной, так и фрагментированной и кольцевой молекулой (таблица 2, рисунок 4).
Таблиц 1 – Виды ДНК-геномов вирусов
Таблица 2 – Виды РНК-геномов вирусов
При обсуждении вопроса организации генома вирусов необходимо выделить ряд его характерных отличий от геномов организмов.
Размеры . Если ориентировочно учесть, что геном эукариот имеет размер 4×109 п.н. и длину, достигающую 1,5-2 метра, а геном прокариот – 6×106 п.н., то размеры геномов вирусов значительно меньше. Так, размер генома крупных ДНК-содержащих вирусов составляет только 2-4×105 п. н. (200-450 т.п.н. у поксвирусов и вирусов герпеса), минимальные вирусы имеют геном длиной 1 мкм и состоящий из 1,2 т.п.н. Самый маленький геном среди вирусов, поражающих человека, имеет вирус гепатита В (3,2 т.п.н.).
Экономичность . Размеры геномов вирусов определяются емкостью капсида вириона. В связи с этим, вирусы очень экономно хранят генетическую информацию, что проявляется отсутствием многократно повторяющихся генов и, часто, наличием перекрывающихся открытых рамок считывания.
Наличие двух типов геномов . Носителем генетической информации у вирусов может быть как ДНК, так и РНК.
Многообразие структурных форм ДНК и РНК . Природа как бы испробовала на вирусах все возможные варианты структурной организации нуклеиновых кислот, которые представлены на рисунок 4.
Рисунок 4 – Схема, иллюстрирующая виды нуклеиновых кислот вирусов
Способ укладки. Способ укладки зависит от вида генома: (+)РНК может быть «голой»; (-)РНК, как правило, ассоциирована с белками нуклеокапсида и образует структуру под названием рибонуклеопротеид (РНП); ДНК вирусов ассоциирована с белками, подобными гистонам эукариот, и организована в виде типичных нуклеосом.
Разнообразие стратегий репликации, основанных на ДНК-зависимом синтезе ДНК, РНК-зависимом синтезе РНК и РНК-зависимом синтезе ДНК.
Изменчивость РНК. Полимеразы, катализирующие репликацию РНК, и обратная транскриптаза имеют минимальные возможности для исправления ошибок синтеза. В результате, частота возникновения ошибок при синтезе РНК приблизительно в 10 тысяч раз выше, чем при репликации ДНК, и она зависит от числа нуклеотидов, составляющих вирусный геном. Это означает, что геном любой индивидуальной частицы РНК- содержащего вируса будет содержать одну или несколько мутаций, отличающих его от последовательности дикого типа данной вирусной разновидности. Этот простой факт имеет далеко идущие последствия для биологии и эволюции РНК-содержащих вирусов, потому что потомство РНК-вируса (природное или лабораторное) представляет собой не совокупность однородных двойников, а скорее молекулярный рой родственных нуклеотидных последовательностей, сгруппированных в месте синтеза последовательностей. Этот молекулярный рой или “квази-разновидность” обеспечивает источник фенотипических вариантов, которые могут быстро ответить на изменяющееся давление естественного отбора. Как следствие, РНК-содержащие вирусы могут эволюционировать в миллион раз быстрее чем, ДНК-организмы. В тоже время высокая изменчивость РНК не обеспечивает быструю эволюцию РНК-содержащих вирусов, так, как размеры генома вирусов налагают верхние пределы на высокую норму ошибок полимеразы. Комбинация уровня репликационных ошибок и размера генома определяют “порог ошибки”, выше которого вирус не может поддерживать целостность последовательности квазиразновидностей. В результате, немногие РНК вирусы имеют размер генома более 30 килобаз (kb), чаще всего он колеблется в пределах 5-15 kb.
Принимая во внимание, что генетически разнообразное потомство может нести летальные мутации, что снижает потенциал для быстрого эволюционного ответа, РНК-геномы этого размера сбалансированы ниже их порогов ошибки.
Детально рассмотрим особенности организации вирусных ДНК и РНК.
Вирусные ДНК.
Молекулярная масса вирусных ДНК варьирует в широких пределах от 1×106 до 250×106. Самые большие вирусные геномы содержат несколько сотен генов, а самые маленькие содержат информацию, достаточную для синтеза лишь нескольких белков.
В геномах, представленных двунитчатыми ДНК, информация обычно закодирована на обеих нитях ДНК. Это свидетельствует о максимальной экономии генетического материала у вирусов, что является неотъемлемым свойством их как генетических паразитов. В связи с этим оценка генетической информации не может быть проведена по молекулярной массе молекул.
Хотя в основном структура ДНК уникальна, т. е. большинство нуклеотидных последовательностей встречаются лишь по одному разу, однако на концах молекул имеются повторы, когда в концевом фрагменте линейной ДНК повторяется ее начальный участок. Повторы могут быть прямыми и инвертированными.
Способность к приобретению кольцевой формы, которая потенциальнозаложена в концевых прямых и, инвертированных повторах, имеет большое значение для вирусов. Кольцевая форма обеспечивает устойчивость ДНК к экзонуклеазам. Стадия образования кольцевой формы обязательна для процесса интеграции ДНК с клеточным геномом. Наконец, кольцевые формы представляют собой удобный и эффективный способ регуляции транскрипции и репликации ДНК.
В составе вирионов, содержащих однонитчатую ДНК, обычно содержатся молекулы ДНК одной полярности. Исключение составляют аденоассоциированные вирусы, вирионы которых содержат ДНК либо одной полярности (условно называемой «плюс»), либо ДНК с противоположным знаком (условно – «минус»). Поэтому тотальный препарат вируса состоит из двух типов частиц, содержащих по одной молекуле «плюс» – ДНК или «минус» – ДНК.
Инфекционный процесс при заражении этими вирусами возникает лишь при проникновении в клетку частиц обоих типов.
Вирусные РНК.
Из нескольких сотен известных в настоящее время вирусов человека и животных РНК-геном содержит около 80 % вирусов. Способность РНК хранить наследственную информацию является уникальной особенностью вируса.
У просто организованных и некоторых сложно организованных вирусов вирусная РНК в отсутствие белка может вызвать, инфекционный процесс. Впервые инфекционная активность РНК вируса табачной мозаики была продемонстрирована X. Френкель-Конратом и соавт. в 1957 г. и А. Гирером и Г. Шраммом в 1958 г. Впоследствии положение об инфекционной активности РНК было перенесено на все РНК-содержащие вирусы, однако долголетние усилия доказать это для таких вирусов, как вирусы гриппа, парамиксовирусы, рабдовирусы (так называемые минуснитевые вирусы), оказались бесплодными: у этих вирусов инфекционной структурой являются не РНК, а комплекс РНК с внутренними белками. Таким образом, геномная РНК может обладать инфекционной активностью в зависимости от своей структуры.
Структура вирусных РНК чрезвычайно разнообразна. У вирусов обнаружены однонитчатые и двунитчатые, линейные, фрагментированные и кольцевые РНК. РНК-геном в основном является гаплоидным, до геном ретровирусов – диплоидный, т.е. состоит из двух идентичных молекул РНК (таблица 2).
Многообразие видов РНК-геномов расширяется за счет существования последовательностей, отличающихся направлением связей сахаро-фосфатного остова. Однонитевые РНК могут иметь позитивную полярность – (+)РНК, негативную полярность – (-)РНК или могут быть представлены обоюдозначащей цепью – (+/-)РНК (амбисенс стратегия кодирования). В свою очередь, РНК позитивной полярности могут иметь разную структурную организацию. Являясь матричной РНК, могут иметь на 5’– конце кэп (7-метилгуанозин), а на 3’-конце – поли-А последовательность; могут не иметь кэпа или поли-А; могут иметь на 5’-конце геномный белок; могут иметь на 3’-конце тРНК-подобную или шпильковую структуру.
Однонитчатые РНК. Молекулы однонитчатых вирусных РНК существуют в форме одиночной полинуклеотидной цепи со спирализованными ДНК-подобными участками. При этом не комплементарные нуклеотиды, разделяющие комплементарные участки, могут выводиться из состава спирализованных участков в форме различных «петель» и «выступов» (рисунок 5). Суммарный процент спирализации вирусных РНК не обнаруживает, каких-либо особенностей по сравнению с таковыми у клеточных РНК.
Рисунок 5 – Вторичная структура вирусных РНК
Вирусы, содержащие однонитчатые РНК, делятся на две группы. У вирусов первой группы вирусный геном обладает функциями информационной РНК, т.е. может непосредственно переносить закодированную в нем информацию на рибосомы. По предложению Д. Балтимора (1971) РНК со свойствами информационной условно обозначена знаком «плюс» и в связи с этим вирусы, содержащие такие РНК (пикорнавирусы, тогавирусы, коронавирусы, ретровирусы), обозначены как «плюснитевые» вирусы, или вирусы с позитивным геномом.
Вторая группа РНК-содержащих вирусов содержит геном в виде однонитчатой РНК, которая сама не обладает функциями иРНК. В этом случае функцию иРНК выполняет РНК, комплементарная геному. Синтез этой РНК (транскрипция) осуществляется в зараженной клетке на матрице геномной РНК с помощью вирусоспецифического фермента – транскриптазы. В составе «минус-нитевых» вирусов обязательно присутствие собственного фермента, осуществляющего транскрипцию геномной РНК и синтез иРНК, так как аналога такого фермента в клетках нет. Геном этих вирусов условно обозначают как «минус» – РНК, а вирусы этой группы как «минус-нитевые» вирусы, или вирусы с негативным геномом. К этим вирусам относятся ортомиксовирусы, парамиксовирусы, буньявирусы, рабдовирусы. РНК этих вирусов не способна вызвать инфекционный процесс.
В соответствии с разными свойствами вирусных РНК между двумя группами вирусов есть и структурные различия. Поскольку РНК «плюс-нитевых» вирусов выполняет функцию иРНК, она имеет специфические структурные особенности, характерные для 5'– и 3'-концов этих РНК. 5'-Конец клеточных и вирусных РНК обычно имеет структуру так называемой шапочки (по-английски «cap»):
где m7G представляет собой 7-метилгуанин, присоединенный через пирофосфатную связь к гуаниловому нуклеотиду, сахарный остаток которого также метилирован по второму углеродному атому. Эти модификации концов иРНК, осуществляемые после синтеза долинуклеотидной цепи, имеют существенное значение для функции иРНК: «шапочка» нужна для специфического узнавания иРНК рибосомами, функции поли (А) менее точно определены и, по-видимому, заключаются в придании стабильности молекулам иРНК. Такими же модифицированными концами обладают геномные РНК «плюс-нитевых» вирусов. Исключение составляет 5'-конец геномной РНК вируса полиомиелита, которая не содержит «шапочку», и вместо нее имеет на 5'-конце ковалентно присоединенный к остатку урацила низкомолекулярный терминальный белок. Геномные РНК «минус-нитевых» вирусов не имеют ни «шапочки», ни поли (А); модифицированные концы характерны для иРНК этих вирусов, синтезирующихся в клетке на матрице вирионной РНК и комплементарных ей. Геномная РНК ретровирусов, хотя и является «плюс-нитевой», однако не содержит «шапочку»; эту структуру содержит гомологичная РНК, синтезируемая на матрице интегрированной провирусной ДНК.
Существуют вирусы, содержащие как «плюс-нитевые», так и «минуснитевые» РНК гены (амбисенс-вирусы). К ним относятся аренавирусы.
В основном однонитчатые РНК являются линейными молекулами, однако РНК-фрагменты буньявирусов обнаружены в виде кольцевой формы. Кольцевая форма возникает за счет образования водородных связей между концами молекул.
Двунитчатые РНК. Этот необычный для клетки тип нуклеиновой кислоты, впервые обнаруженный у реовирусов, широко распространен среди вирусов животных, растений и бактерий. Вирусы, содержащие подобный геном, называют диплорнавирусы.
Общей особенностью диплорнавирусов является фрагментированное состояние генома. Так, геном реовирусов состоит из 10 фрагментов, ротавирусов – из 11 фрагментов.
3.6.2 Хранение генетической информации. Способы увеличения информационной емкости вирусного генома
Как и в других живых системах, у вирусов соответствие между аминокислотной последовательностью белка и нуклеотидной последовательностью геномной нуклеиновой кислоты устанавливается с помощью универсального вырожденного генетического кода, где кодирующей единицей является триплет нуклеотидов (кодон). В вирусных системах используются те же наборы кодоновых значений, что и в бактериальных, архейных и эукариотических системах. Однако у вирусов генетическая информация может храниться, как в смысловой полинуклеотидной цепи, так и в последовательности матричной цепи.
Для сохранения генетической информации в окружающей среде и передачи ее новому поколению вирусы упаковывают геномные нуклеиновые кислоты в белковый капсид и часто в суперкапсид (липидсодержащая оболочка), формируя внеклеточную форму вируса – вирион. Как правило, вирионы, попадая в клетку, обеспечивают продуктивный инфекционный цикл, давая вирусное потомство. Однако целый ряд так называемых интегративных вирусов встраивают свой геном в хромосомы хозяина, в том числе клеток зародышевой линии, обеспечивая длительное сохранение генетической информации вируса в ряду поколений хозяина.
Несмотря на микроскопические размеры, нуклеиновые кислоты вирусов несут информацию не только о капсидных белках, но и о ферментах, необходимых для синтеза ДНК, РНК и их модификации, для синтеза РНК транскриптов и их процессинга, для обеспечения синтеза белков и их посттрансляционной модификации и воздействия на биосинтетические процессы клетки-хозяина. Данный факт объясняется наличием разнообразнейших механизмов увеличения генетической информации. Так, к способам увеличения информационной емкости вирусного генома являются: 1) двукратное считывание одной и той же иРНК, но с другого инициирующего кодона; 2) сдвиг рамки трансляции; 3) сплайсинг; 4) транскрипция с перекрывающихся областей ДНК и др.
Так, генетический материал мелкого бактериофага φХ174 представлен одноцепочечной ДНК и состоит всего из 9 генов, продукты которых хорошо изучены. ДНК, необходимая для кодирования этих продуктов, должна состоять минимум из 6078 нуклеотидов. На самом же деле хромосома фага состоит из 5374 нуклеотидов. Этот парадокс был разрешен после проведения в 1978 г. группой Ф.Сенгера полного секвенирования ДНК этого фага. Оказалось, что кодирующие последовательности двух генов (В и Е) локализованы внутри кодирующих последовательностей двух других генов (А и D). При этом рамка считывания в каждом случае оказывалась сдвинутой на одну пару нуклеотидов. Например, в определенном участке внутри гена D находится последовательность, которая в полипептиде D кодирует последовательность Валин-тирозин-глицин-треонин. Рамка считывания гена Е смещена вправо на один нуклеотид от рамки считывания гена D. Поэтому триплет ATG распознается РНК-полимеразой как стартовый и в полипептиде Е появляется формилметионин, за которым последует Валин, кодируемый триплетом GTA, и т.д.
Сходным образом кодирующая последовательность гена В оказывается внутри кодирующей последовательности гена А. В результате сдвига рамки считывания кодируемые перекрывающимися генами полипептиды полностью отличаются друг от друга по последовательностям аминокислот. Вместе с тем в случае замены или делеции одного нуклеотида инактивируются сразу два гена.
Подобная ситуация «ген внутри гена» обнаружена в ряде других случаев. Частично перекрывающиеся кодирующие последовательности обнаружены в ДНК вируса млекопитающих SV40. У РНКового фага МS2 один из генов перекрывает два других и, следовательно, не перекрывается лишь один из фаговых генов.
В составе иРНК обычно встречается несколько инициирующих кодонов. В соответствии с принятой в настоящее время гипотезой «сканирующей модели» малая рибосомальная субъединица связывается с иРНК около 5'-конца и скользит вниз до встречи с инициирующим кодоном. Однако инициация в большинстве случаев происходит не с первого инициирующего кодона, а с последующих АУГ-кодонов. «Правильный» функционирующий АУГ-кодон узнается рибосомой благодаря окружающим его последовательностям («фланкирующим нуклеотидам»). В том случае, если первый инициирующий кодон находится в менее благоприятном окружении, чем последующие АУГ-кодоны, большинство малых рибосомальных субъединиц пройдут этот кодон и начнут инициацию трансляции с последующих АУГ-кодонов, однако некоторые субъединицы начнут инициацию с первого АУГ-кодона. В этом случае одна иРНК может направить синтез двух белков разной длины. Такие иРНК имеются у многих вирусов: SV40, герпеса, аденовирусов, буньявирусов, реовирусов и др.
Трансляция может происходить без сдвига рамки и со сдвигом рамки. Генетический код является триплетным, это означает, что три нуклеотида, составляющих триплет, или кодон, кодируют одну аминокислоту. В том случае, если триплеты сохранены и генетический код не изменился, то при трансляции с двух разных инициирующих кодонов будут синтезироваться полипептиды, представляющие собой укороченную копию первого полипептида (трансляция без сдвига рамки).
В том случае, если произошел сдвиг на один или два нуклеотида, образуются новые триплеты (кодоны) и появляется новый генетический код. В этом случае одна молекула иРНК может транслироваться с образованием двух уникальных белков, т.е. таких белков, у которых нет идентичных аминокислотных последовательностей.
Сплайсинг со сдвигом рамки широко используется у ряда вирусов (вирусы гриппа, парамиксовирусы, буньявирусы, аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы и др.). Например, все три иРНК аденоассоциированного вируса образуются при транскрипции одного гена и имеют общий З'-конец, самая короткая иРНК образуется путем сплайсинга и транслируется с образованием трех структурных белков, остальные две иРНК транслируются с образованием неструктурных белков. В результате сплайсинга и сдвига рамки иРНК 7-го и 8-го генов вируса гриппа транслируются с образованием двух белков: полипептидов M1 и М2 (продукты 7-го гена) и NS1 и NS2 (продукты 8-го гена). Белки NS1 a NS2 имеют лишь первые 10 идентичных аминокислот, а затем – уникальные аминокислотные последовательности. Один и тот же ген парамиксовирусов (вирус Сендай) кодирует два уникальных белка: структурный белок Р и неструктурный белок С.
Одним из способов экономии генетического материала является нарезание полипептида-предшественника на участки разной длины, в результате чего образуются разные полипептиды с перекрывающимися аминокислотными последовательностями. Подобный механизм нарезания имеет место у аденоассоциированных вирусов и у SV40.
Таким образом, число реальных генов превосходит молекулярную массу генома. В результате перекрывания генов и сдвига рамки трансляции «размываются» границы генов, и понятие «ген» в известном смысле утрачивает первоначальное значение как дискретный фрагмент генома и приобретает скорее функциональное значение.
3.7 Реализация генетической информации у вирусов
Процесс репродукции вирусов может быть условно разделен на две фазы (рисунок 6). Первая фаза охватывает события, которые ведут к адсорбции и проникновению вируса в клетку, освобождению его внутреннего компонента и модификации его таким образом, что он способен вызвать инфекцию. Стадии первой фазы направлены на то, чтобы вирус был доставлен в соответствующие клеточные структуры, и его внутренний компонент был освобожден от защитных оболочек. Как только эта цель достигнута, начинается вторая фаза репродукции, в течение которой происходит экспрессия вирусного генома. Эта фаза включает в себя стадии:
1) репликации генома;
2) транскрипции;
3) трансляции информационных РНК;
4) сборки вирусных компонентов.
Заключительной стадией репродукции является выход вируса из клетки.
1 – адсорбция вириона на клетке; 2 – проникновение вириона в клетку путем виропексиса; 3 – вирус внутри вакуоли клетки; 4 – раздевание вириона вируса; 5 – репликация вирусной нуклеиновой кислоты; 6 – синтез вирусных белков на рибосомах клетки; 7 – формирование вириона; 8 – выход вириона из клетки путем почкования.
Рисунок 6 – Стадии репродукции вирусов (Микробиология и иммунология Под редакцией Воробьева А.А., М., 1999)
Адсорбция вируса обеспечивается взаимодействием его поверхностных белков со специфическими рецепторами чувствительных клеток. Проникновение вируса в клетку происходит либо путем виропексиса (рецепторного эндоцитоза), либо слияния оболочки вируса с клеточной мембраной (при наличии белка слияния), или в результате сочетания этих двух механизмов. В процессе проникновения вириона в клетку при участии клеточных ферментов происходит его депротеинизация, в результате которой удаляются поверхностные структуры вируса, и высвобождается его внутренний компонент (сердцевина, нуклеокапсид, нуклеиновая кислота).
Вирусная нуклеиновая кислота доставляется в соответствующие клеточные структуры и под действием лизосомальных ферментов клетки освобождается от защитных белковых оболочек. В итоге формируется уникальная биологическая структура: инфицированная клетка содержит 2 генома (собственный и вирусный) и 1 синтетический аппарат (клеточный).
При реализации внутриклеточной стадии жизненного цикла вирус осуществляет три молекулярных процесса: репликацию геномной нуклеиновой кислоты, транскрипцию и трансляцию. На каждой стадии вирус вмешивается в клеточные синтетические механизмы и подчиняет их своим задачам, создавая приоритеты для вирусных нуклеиновых кислот.
Биосинтез вирусных компонентов осуществляется в разных частях клетки, поэтому называется дизъюнктивным (от лат. disjunctus – разобщенный). Белки вируса синтезируются в результате транскрипции, т.е. переписывания информации с генома вируса на информационную РНК (иРНК) и последующей трансляции (считывание иРНК на рибосомах) с образованием белка вируса. Вирусная нуклеиновая кислота кодирует синтез структурных и неструктурных белков вируса. Структурные белки входят в состав вириона, а неструктурные – являются ферментами и обеспечивают репродукцию вируса. Одновременно с синтезом белка в клетке происходит и репликация (от лат. replicatio – повторение), т.е. синтез вирусных нуклеиновых кислот.
Формирование вирионов происходит путем самосборки: составные части вириона транспортируются в места сборки вируса в ядре или цитоплазме. Сборка компонентов вириона происходит за счет гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия. В результате самосборки капсомеров, образовавшихся из вирусных полипептидов, и взаимодействия их с нуклеиновыми кислотами вируса образуются нуклеокапсиды. Суперкапсидная оболочка сложноорганизованных вирусов включает в себя кроме вирусспецифических белков еще компоненты мембраны клетки. Вновь сформировавшиеся вирионы пассивно в результате гибели клетки или активно путем почкования покидают клетку и оказываются в окружающей ее среде.
Таким образом, синтез вирусных нуклеиновых кислот и белков и сборка новых вирионов происходят в определенной последовательности (разобщены во времени) и в разных структурах клетки (разобщен в пространстве), в связи с чем способ репродукции вирусов и был назван дизъюнктивным (разобщенным). При абортивной вирусной инфекции процесс взаимодействия вируса с клеткой по тем или иным причинам прерывается до того, как произошло подавление клеточного генома. Очевидно, что в этом случае генетическая информация вируса реализована не будет и репродукции вируса не происходит, а клетка сохраняет свои функции неизменными. При латентной вирусной инфекции в клетке одновременно функционируют оба генома, а при вирус-индуцированных трансформациях вирусный геном становится частью клеточного, функционирует и наследуется вместе с ним.
3.7.1 Репликация
Репликация геномов вирусов – это матричный комплементарный синтез нуклеиновых кислот, преследующий целью наработку геномных последовательностей для инкапсидации в вирион. ДНК-геномы реплицируются клеточными или вирусоспецифическими ДНК-полимеразами. РНК-геномы реплицируются вирусоспецифическими РНК-полимеразами, которые также являются и транскриптазами.
3.7.1.1 Основные принципы и механизмы репликации у вирусов
Репликация вирусных геномов происходит или одновременно с транскрипцией, или эти два процесса разделены во времени. Механизмы репликации геномов вирусов многообразны и определяются видом генома. Существует три модели репликации – полуконсервативная, консервативная и дисперсная.
Консервативная и дисперсная модели репликации нуклеиновых кислот установлены только у вирусов. Полуконсервативная модель предполагает, что после первого раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних молекул является родительской, другая – синтезируемой заново. По такой схеме реплицируются вирусов, геном которых представлен двунитевой ДНК. При реализации консервативной модели репликации одна дочерняя молекула состоит из двух родительских цепей, а другая – из вновь синтезированных цепей. Согласно консервативной модели реплицируются двунитевые РНК ротавирусов (семейство Reoviridae). ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся таким образом, неизвестны. Дисперсная модель репликации приводит к образованию молекулы нуклеиновой кислоты, состоящей из фрагментов, как родительских цепей, так и вновь синтезированных. Дисперсная модель реализуется, например, на промежуточной стадии репликации онДНК-генома парвовирусов (семейство Parvoviridae).
Инициация синтеза цепи ДНК может происходить только при наличии затравки для ДНК-полимеразы. Вид затравки и способ ее образования различаются у разных вирусов и определяют своеобразие вирусных репликативных систем. Различают три основных способа инициации синтеза ДНК:
1 Инициация на внутренних участках ДНК – характерна для кольцевых матриц. Затравкой служит олигорибонуклеотид, который может быть синтезирован ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой. Эти ферменты могут иметь клеточное происхождение, или быть вирус-специфическими. Синтезироваться может одна затравка или несколько затравок.
На однонитевой матрице затравка синтезируется на определенном участке, узнаваемом ферментом. Двухнитевая матрица сначала подготавливается к инициации. На участке ori происходит присоединение хеликазы. Этот фермент расплетает участок матрицы, что приводит к образованию репликативной вилки с последующим синтезом затравки.
2 Инициация на концах ДНК (терминальная инициация) – характерна для линейных матриц. Различают две группы способов концевой инициации ДНК-синтеза: с использованием нуклеотидбелковой затравки и с использованием самозатравочного механизма.
3 Инициация синтеза с использовании разрывов и брешей – затравкой для дальнейшего удлинения цепи может быть 3'-ОН конец разорванной цепи ДНК.
Элонгация цепи при репликации вирусных геномов принципиально не отличается от процесса синтеза клеточных ДНК. Используются ферменты, вспомогательные белки и репликационные белки, принадлежащие как клетке хозяина, так и вирусу. Синтез ДНК, как правило, осуществляет ДНК-зависимая ДНК-полимераза II, в редких случаях – ДНК-полимераза III. Основным свойством синтеза является его полярность, при которой очередной нуклеотид присоединяется к 3'-концу растущей цепи. То есть направление синтеза идет от 5'– к 3'-концу, считывание – от 3'– к 5'концу. Особенности синтеза комплементарных нитей связаны со способом инициации. На днДНК матрице синтез идет через образование репликативной вилки или с вытеснением цепи, на онДНК-матрице – по репарационному механизму.
Стандартный механизм полуконсервативной репликации ДНК с образованием репликативной вилки включает следующие стадии:
1 Инициация репликации расплетением днДНК хеликазой. Репликация начинается не в случайной точке, а в специфическом месте, называемом точкой начала репликации (ori), которых может быть одна или несколько.
2 Синтез РНК-затравки ДНК-зависимой РНК-полимеразой, праймазой или праймосомой.
3 Синтез комплементарных цепей ДНК-полимеразой (II, III). Цепи ДНК синтезируются в результате присоединения дезоксинуклеотидов к 3'-концу растущей цепи, то есть в направлении от 5'– к 3'-концу вдоль матричной цепи. Синтеза цепей в обратном направлении не происходит. Поэтому синтезируемые цепи в репликативной вилке растут в противоположных направлениях. Синтез одной цепи происходит непрерывно – это ведущая, или лидирующая цепь. Синтез другой цепи идет импульсами – это отстающая цепь. Лидирующая цепь синтезируется в направлении роста репликативной вилки, отстающая – в обратном направлении в результате нескольких актов инициации. В итоге образуется несколько коротких цепей (фрагментов Оказаки), которые затем соединяются с образованием непрерывной отстающей цепи. Механизм репликации лидирующей и отстающей цепей в принципе одинаков и требует синтеза коротких РНК-затравок, комплементарных матричной цепи. Скорость копирования в репликативной вилке постоянна и равна 1,5 т.п.н./с.
4 Дезинтеграция РНК-затравки РНКазой Н.
5 Сшивание фрагментов Оказаки ДНК-лигазой.
6 Снятие сверхспирализации топоизомеразами (топоизомераза I – вносит разрывы в одну цепь, топоизомераза II – вносит разрывы в обе цепи).
Терминация синтеза.
1 Терминация синтеза и расхождение кольцевых геномов упрощены, поскольку синтез цепи идет по кругу и в конце полного оборота в точке ori или при двунаправленной репликации в середине кольца 3'– и 5'-концы вновь синтезированной цепи совмещаются и лигируются. Попарно сцепленные кольца разъединяются топоизомеразой.
2 В линейных ДНК, синтезированных с помощью РНК-затравок, все обстоит сложнее. Удаление РНК-праймера дает молекулу ДНК с выступающим 3'-концом и пробелом на 5'-конце. Предложено 2 способа завершения репликации с образованием полной копии матричной цепи (рисунок 7).
В 1972 г. Уотсон предложил модель завершения репликации ДНК с прямыми повторами на концах через образование конкатемеров, которые представляют собой несколько тандемно-повторяющихся единиц генома. После образования конкатемера специфическая эндонуклеаза вносит ступенчатый разрыв в месте воссоединения. Это приводит к образованию выступающих 5'-концов и пробелов на 3'-конце, которые наращиваются ДНК-полимеразой. Бреши закрываются или путем репарации или лигирования.
Синтез полноразмерных линейных ДНК с инвертированными повторами на концах может быть завершен через образование шпильки. Инвертированные повторы – это две копии одной и той же последовательности ДНК в составе одной молекулы, находящиеся в противоположной ориентации. Прилежащие друг к другу инвертированные повторы образуют палиндромы. На рисунке 7 показано, что терминация 3'-конца через образование шпильки включает лигирование 3'-конца шпильки с 5'-концом комплементарной цепи, внесение одноцепочечного разрыва с образованием выступающего 3'-конца и его удлинение.
а – через образование конкатемеров; б – через образование шпильки.
Рисунок 7 – Схемы терминации синтеза линейных ДНК
3.7.1.2 Основные принципы и механизмы репликации РНК-геномов
РНК-содержащие вирусы – единственные известные создания природы, использующие РНК в качестве генетического материала. Чтобы осуществить экспрессию, репликацию и перенос генов, различные семейства РНК-содержащих вирусов развили разнообразные генетические стратегии и жизненные циклы, которые эксплуатируют биологию и биохимию их хозяев многими различными способами. Эти вирусы копируют свои геномы с использованием одного из двух уникальных биохимических путей: или путем РНК-зависимого синтеза РНК (репликация РНК) или, как ретровирусы, РНК-зависимого синтеза ДНК (обратная транскрипция), который сопровождается репликацией ДНК и транскрипцией. Эти пути требуют работы ферментов, которые обычно отсутствуют в неинфицированных клетках-хозяевах. В связи с этим, данные ферменты должны быть генетически детерминированы вирусом и экспрессированы в течение инфекции. В некоторых семействах РНК-содержащих вирусов эти уникальные синтетические процессы необходимы на первых стадиях инфекционного цикла, что требует наличия упакованных в вирион полимеразы и других ферментов, необходимых для осуществления следующего цикла инфекции.
Внутриклеточные места репликации РНК-геномов вирусов. Основная масса РНК-содержащих вирусов реплицируется в цитоплазме. Однако известен ряд исключений из этого правила. В дополнение к ретровирусам, которые синтезируют ДНК копии своих геномов и встраивают их в клеточные хромосомы, ортомиксо- и борнавирусы, чей геном представлен линейной (-)РНК, и кольцевая РНК вируса гепатита дельта, подобная вироидам растений, также реплицируются в ядре. Каждый компартмент клетки имеет свои возможности и резервы, определяемые доступностью клеточных компонентов и биохимических путей, которые могут быть использованы и скоординированы вирусами.
Уровни сегментации: гены, мРНК и белки. Разделение эукариотических клеток на ядерные и эндоплазматические компартменты глубоко влияет на биологию вирусов. Рибосомы эукариот требуют метилированной кэп-структуры на 5’-конце мРНК, которая играет критическую роль в передаче сигналов инициирования белкового синтеза. В результате, эукариоты подчиняются правилу – «одна мРНК – одна полипептидная цепь», и, за немногими исключениями, каждая мРНК функционирует как отдельная единица трансляции. РНК-зависимые РНК-полимеразы вирусов обладают ограниченной способностью к взаимодействию с внутренними инициирующими сайтами РНК-матриц, что создает проблему получения нескольких индивидуальных белков на основе единственного генома. В процессе эволюции различные семейства РНК-содержащих вирусов нашли три решения этой проблемы: фрагментация на уровне белков, образование субгеномных мРНК, сегментация генома. Например, РНК-вирусы семейств Picorna-, Toga-, Flavi– и Retroviridae для того, чтобы получить функциональные белковые продукты используют протеолитическое расщепление полипротеина-предшественника. Вирусы других семейств – Сorona-, Аrteri-, Rhabdo-, Paramyxoviridae – зависят от сложных механизмов транскрипции и чтобы произвести несколько различных моноцистронных мРНК с единственной РНК- матрицы вынуждены синтезировать субгеномные мРНК. Представители семейств Reo-, Orthomyxo-, Bunya-, Arenaviridae и др. решили проблему, фрагментируя геномы. При этом вирионы содержат многократные доли генома, каждый из которых часто представлен единственным геном. У вирусов растений такие доли РНК генома могут пакетироваться в отдельные вирионы (явление мультипартитности), требуя инфекции несколькими вирусными частицами для обеспечения инвазивной способности вируса, в то время, как сегменты генома вирусов животных обычно пакетированы совместно. Напротив, ДНК вирусы редко используют или сегментацию генома или синтез полипротеина. Это вероятно связано с относительной простотой синтеза моноцистронных мРНК, которая может быть транскрибирована с внутренних промоторов на двунитевой ДНК и подвергнута альтернативному сплайсингу, подобно ядерным транскриптам клетки.
Каждая разновидность РНК-генома имеет свои стратегии репликации, экспрессии генов и упаковки в вирионы.
Одно- и двунитевые РНК-геномы вирусов. Хотя все РНК-геномы реплицируются обычным способом комплементарного спаривания нуклеотидных оснований матрицы и дочерней нити, различные семейства РНК-содержащих вирусов реализуют различные молекулярные стратегии репликативного цикла РНК и ее инкапсидации. Семейства однонитевых РНК-вирусов превосходят численностью семейства вирусов с двунитевой РНК геномом почти в 10 раз.
Чтобы ограничить накопление промежуточных репликативных форм, содержащих области двунитевых РНК, вирусы разработали стратегии, различающиеся у (+)РНК и (-)РНК. Все (+)РНК-содержащие вирусы синтезируют непропорционально низкие уровни негативных нитей – от 1 % до 5 % от уровня положительной РНК и таким образом минимизируют потенциал для накопления двунитевой РНК. Наоборот, (-)РНК-вирусы нуждаются в существенных количествах (+)РНК нитей, чтобы использовать их в качестве матрицы для синтеза геномного потомства. Обычно ()РНК-вирусы предотвращают отжиг (+) и (-) нитей, сохраняя геномную РНК в составе нуклеокапсида.
(+)РНК и (-)РНК геномы. Различия между положительным и отрицательным РНК-геномами определяются полярностью нитей, инкапсидированных в вирионы. (+)РНК-геном в начале инфекции использует синтезированные на рибосомах вирусоспецифические белки и клеточные РНК-связывающие белки. После того, как синтезированные вирусоспецифическая РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) и другие неструктурные белки покидают рибосомы, начинается репликация РНК. Затем вновь синтезированные структурные белки вириона и РНК ассемблируют с образованием вирусного потомства. В противовес этому, (-)РНК-геномы и их антигеномные комплементы остаются связанными с белками нуклеокапсида, как в пределах вирусных частиц, так и в течение всего цикла вирусной репликации. Эти фундаментальные адаптационные различия основаны на том, что геномы положительной полярности должны удовлетворять трансляционным критериям, которые диктуются клеткой-хозяином, в то время как негативные геномы и антигеномы должны удовлетворять только матричным требованиям вирусоспецифической RdRp, в связи с тем, что они копируются, но никогда не транслируются. Хотя до настоящего времени остается неясным, как полимераза может копировать покрытые белком РНК-матрицы. днРНК-геномы являются промежуточными между этими крайностями: родительские доли генома остаются изолированными в субвирусных частицах на протяжении всего инфекционного цикла.
Однако следует учитывать, что положительные нити-предшественники двунитевого РНК потомства изначально не инкапсидированы. Вероятно, эти вариации отражают существенные различия в структурах вирусных комплексов RdRp-матрицах и в молекулярных механизмах репликации положительных, отрицательных и двунитевых РНК-геномов.
Линейные и кольцевые РНК-геномы. Репликация РНК не только требует сохранения приемлемого уровня ошибок, как обсуждено ранее, но также должна избегать систематических делеций или вставок нуклеотидов. Особенно подвержены изменениям концевые последовательности геномов, дублирование которых представляет проблему.
При репликации ДНК проблема терминации синтеза усилена тем, что ДНКполимераза не может начать синтез дочерней нити de novo, для чего требуется наличие затравки. Это создает дополнительные сложности, связанные с копированием праймер-связывающей последовательности. Одним из нескольких известных, наиболее экономичных и широко распространенных в природе решений этой проблемы является устранение концов путем образования кольцевой ДНК, как в прокариотических геномах. В отличие от ДНК-полимераз, большинство РНК-полимераз не требует затравок, так что РНК-геномы менее восприимчивы к проблеме концов. Соответственно, большинство РНК-геномов вирусов – линейные молекулы. Ковалентно замкнутые кольцевые РНК найдены только у вируса гепатита дельта животных, среди вироидов и некоторых других субвирусных РНК-патогенов, которые инфицируют растения. Однако концы линейных рибонуклеиновых кислот особенно чувствительны к деградации и их репликация особенно склонна к ошибкам. Следовательно, каждое семейство РНК-вирусов имеет особенности, разработанные для сохранения концов генома. Например, множество РНК-геномов положительной полярности несут 5’-кэп и 3’-поли-A трек, которые защищают от деградации концы последовательности эукариотических мРНК. Подобную роль, вероятно, выполняет геномный белок (Vpg), который ковалентно связан к 5’-концом РНК пикорнавирусов, а также устойчивые вторичные структуры РНК, найденные на 3’-конце РНК флавивирусов и в других геномах. 3’-концы многих рибонуклеиновых кислот вирусов растений формируют структуры типа «кленового листа», которые подобны клеточным тРНК. Кроме этого, в (+)РНК вирусов обнаружены модификации, которые могут служить для соединения ее концов. Эти модификации опосредуют взаимодействие 3’-конца с клеточными белками типа поли-A-связывающего белка и кэп-связывающего комплекса, что приводит к формированию нековалентно замкнутых функциональных комплексов, которые могут повторно промотировать трансляцию рибосомами и повторно реплицироваться RdRp's. В отличие от (+)РНК-геномов вирусов, негативные – и амбисенс РНК-геномы редко несут ковалентные концевые модификации. Эти рибонуклеиновые кислоты обычно обладают некоторой степенью комплементарности концевой последовательности, которая, как думают, стабилизирует вирусный нуклеокапсид и промотирует репликацию РНК, возможно, делая матрицу функционально кольцевой, как описано для рибонуклеиновых кислот положительной полярности. Концевая комплементарность последовательности также позволяет концам РНК выступать в роли теломеров и служить 5’-концевой матрицей для восстановления разрушенных 3’-концевых нуклеотидов. Другое решение проблемы концов имеется у некоторых (+/-)РНК-содержащих аренавирусов. Эти вирусы устойчивы к концевым изменениям и способны допустить существенный уровень вариабельности концевых последовательностей генома, возможно, располагая необходимыми внутренними cisacting сигналами, далеко отстоящими от концов РНК. Ретровирусные геномы наоборот избыточны, и имеют прямые повторы между 12 и 235 нуклеотидами на каждом конце. Эти прямые повторы поддерживают и восстанавливают целостность концов РНК в течение обратной транскрипции и вирусной репликации. Сегментированные и несегментированные РНК-геномы. Сегментация генома вирусов облегчает производство индивидуальных продуктов в эукариотических клетках. В тоже время это означает, что каждая доля генома для обеспечения экспрессии, репликации и 28 сборки вирионов должна содержать соответствующие регуляторные cis-acting сигналы. В некоторых семействах вирусов с сегментированным геномом (Orthomyxoviridae, Reоviridae) эти сигналы включают консервативные для всех сегментов концевые последовательности, но у вирусов других семейств (бипартитные Noda- и Tetraviridae), существенных консервативных последовательностей у разных долей генома не выявлено.
В этих случаях специфичность репликации РНК и сборки вирионов, возможно, определяется консервативностью вторичной или третичной структуры РНК. Однако механизмы, которые координируют репликацию и упаковку различных сегментов генома, остаются плохо понятыми для любого вируса эукариот.
Сегментация генома вируса оказывает существенное влияние на его биологию, потому что индивидуальные сегменты могут часто подвергаться реассортации в клетках, инфицрованных двумя штаммами вируса, позволяя вирусам с сегментированным геномом делать существенные эволюционные прыжки посредством горизонтальной передачи генов. Этот механизм лежит в основе антигенных изменений (антигенный шифт), обеспечивающих возникновение новых пандемичных штаммов вируса гриппа из семейства Orthomyxoviridae.
Cis-аcting сигналы и специфичность репликации. Репликация и упаковка вирусных РНК являются удивительно специфичными процессами. Оба этих процесса безошибочно выбирают правильные вирусные молекулы из числа тысяч рибонуклеиновых кислот, содержащихся в клетке. Это в основном связано с присутствием сis-аcting сигналов, которые селективно определяют репликацию вирусных РНК и сборку вирионов, но в большинстве РНК-геномов вируса эти сигналы до конца ясно не идентифицированы.
Сигналы, которые были охарактеризованы, включают не линейные нуклеотидные последовательности, а вторичные структуры в виде петель, тРНК-подобных структур и псевдоузлов, которые создают специфические трехмерные молекулярные формы, способные взаимодействовать только с вирусными ферментами и структурными белками вируса. Однако понимание молекулярных основ специфичности репликации РНК и сборки вирионов ограничено недостатком знаний трехмерных структур вирусной РНК и ее действующих сis-аcting сигналов.
Сателлитные РНК и дефектные РНК геномы. Иногда в инфицированных клетках обнаруживаются молекулы РНК, которые не являются ни независимо инфекционными, ни существенными для инвазионной способности вируса, но однако содержат действующие сis-аcting сигналы, активирующие их собственную репликацию и/или упаковку в белки, кодируемые другим вирусом. Такие спутниковые (сателлитные) РНК, паразитирующие на материнском вирусе, могут модулировать его репликацию и вирулентность. Среди РНК-содержащих вирусов животных основным примером вируса сателлита является вирус гепатита дельта, который упаковывает свой геном в белки, кодируемые вирусом гепатита B, и может существенно усиливать его патогенность. Паразитирование РНК-сателлита на ДНК-содержащем вирусном родителе необычно; как правило, спутниковые РНК копируются и инкапсидируются в белки РНК-содержащего вируса-родителя, с которым они имеют, по крайней мере, некоторую, гомологию последовательностей. В ряде случаев, сателлитные РНК кодируют собственные белки капсида, или белки, требуемые для репликации РНК (как в случае вируса гепатита дельта), но чаще они с точки зрения трансляции не активны. Сателлитные РНК чаще встречаются среди вирусов растений, чем среди вирусов животных, возможно, потому что трансмиссия животных вирусов между хозяевами происходит путями, которые не оптимальны для сателлитов.
В отличие от передачи вирусной инфекции между хозяевами, распространение инфекции в пределах одного организма животного обычно вовлекает последовательные эпизоды ограниченной вирусной репликации. Эти состояния формируют поколение и увеличивают число дефектных вирусных РНК, которые являются результатом, как простых делеций, так и более сложных перестроек генома, происходящих в процессе репликации РНК. Подобно сателлитным РНК, дефектные РНК паразитируют на материнском вирусе и мешают его репликации. Однако дефектные вирусы в своем выживании полностью зависят от материнского вируса. Большинство семейств рибовирусов животных с готовностью производят дефектные интерферирующие РНК в культуре клеток, но их влияние на развитие вирусной болезни до конца не изучено.
Структурные и неструктурные белки вирусов. По определению, вирусоспецифические структурные белки включены в вирусные частицы, а неструктурные белки найдены только в инфицированных клетках. Однако вирусы с негативным, амбиполярным и двунитевыми РНК-геномами включают в потомство вирионов RdRp и ассоциированные ферменты и поэтому кодируют преимущественно или исключительно структурные белки. В дополнение к полимеразе, кодируемые вирусом ферменты часто включают одну или несколько протеаз, РНК-хеликазу, гуанилил- и метилтрансферазы, поли-А-полимеразу, иногда нуклеазу, а в случае ретровирусов – ДНК-интегразу. В тоже время, для нескольких РНК-вирусов установлено участие в репликативном цикле ферментов клетки-хозяина.